血液樣本是ELISA中最常見的生物液體樣本,其中在檢測上有全血、血清、血漿、血凝塊和血細胞的區(qū)分,ELISA常用血清和血漿。
血液是一種流體組織,在心血管系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)流動,起著運輸物質(zhì)的作用。血液組織是結(jié)締組織的一種,由血漿和血細胞組成。
血漿內(nèi)含血漿蛋白(白蛋白、球蛋白、纖維蛋白原)、脂蛋白等各種營養(yǎng)成分以及無機鹽、氧、激素、酶、抗體和細胞代謝產(chǎn)物等。血細胞有紅細胞、白細胞和血小板。
哺乳類的血液具有凝血機制,血管破裂時,血小板會結(jié)集,堵塞血管破口,此時血漿中原本可水溶的血纖維蛋白等凝固成為XUEKUAI,剩余的透明液體就叫做血清。
從采集樣本來說,直接抽取采集的為全血,呈紅色。靜置后1-2h,會發(fā)生凝血反應,形成血清(呈黃色透明液體)和血凝塊。在收集管中提前加入抗凝劑,混勻后離心,即可分離出血漿。
血清和血漿樣本的主要區(qū)別在于血漿中抗凝劑和凝血因子的影響。
多數(shù)指標中血漿樣本可以替代血清,前提是該指標不受抗凝劑成分和凝血因子的影響(如抗體類項目),但生化指標則不可用EDTA抗凝分離血漿,因為EDTA-K2此種抗凝劑不僅可以絡合重金屬Mg2+,也會致使K+的含量上升,故生化指標的最佳樣本是血清。一般全血能收集到30-50%左右的血清/血漿。
血紅蛋白類指標需采用溶血劑破碎血細胞后來進行測定,凝血因子類指標需使用血漿,其他部分指標血清血漿中有較大差異,血清血漿樣本類型的選取,建議多參考國內(nèi)外文獻,選擇合適的樣本類型
真空采血管是采血材料中裝血液標本的試管,管內(nèi)有真空壓力,在護士采血操作穿刺達到血管后,把穿刺針另一端插入試管,血管內(nèi)的血液通過管內(nèi)真空壓力自然把血管內(nèi)的血液往試管內(nèi)排出,當達到一定采血量后管內(nèi)的壓力自然減小,不會繼續(xù)出血。需要護士采血操作時使用,如果是事先把試管蓋打開,管內(nèi)的壓力就會改變,不是成負壓狀態(tài)就沒有真空壓力的作用。
除紅頭管無添加外,其他采血管中均含有添加劑,需采血后顛倒混勻5/8次。血清管凝集后離心分離出血清,血漿管需要混勻后離心分離出血漿。用于ELISA測試的樣本建議于 4℃保存24h 內(nèi)完成離心分離,避免長時間存放/凍融引起血細胞破碎,發(fā)生溶血反應影響ELISA實驗。
動物采血管少量采血,建議采用無菌無毒素的離心管收集,自然凝集后離心分離血清;或抗凝離心管(肝素/EDTA分離血漿),輕輕顛倒混勻后離心分離血漿。
將清醒鼠裝入深顏色的布袋中,將鼠身裹緊,露出尾巴,用酒精涂擦或用溫水浸泡使血管擴張,剪斷尾尖后,尾靜脈血即可流出,用手輕輕地從尾根部向尾尖擠捏,可取到一定量的血液。取血后,用棉球壓迫止血。也可采用交替切割尾靜脈方法取血。用一鋒利刀片在尾尖部切破一段尾靜脈,靜脈血即可流出,每次可取0.3~0.5 ml,供一般血常規(guī)實驗。三根尾靜脈可替換切割,由尾尖向根部切割。由于鼠血易凝,需要全血時,應事先將抗凝劑置于采血管中,如用血細胞混懸液,則立即與生理鹽水混合。
左手持鼠,拇指與中指抓住頸部皮膚,食指按壓頭部向下,阻滯靜脈回流,使眼球后靜脈叢充血,眼球外突。右手持1%肝素溶液浸泡過的自制吸血器,從內(nèi)呲部刺入,沿內(nèi)下眼眶壁,向眼球后推進4~5 mm,旋轉(zhuǎn)吸血針頭,切開靜脈叢,血液自動進入吸血針筒,輕輕抽吸血管(防止負壓壓迫靜脈叢使抽血更困難),拔出吸血針,放松手壓力,出血可自然停止。也可用特制的玻璃取血管(管長7~10 cm,前端拉成毛細管,內(nèi)徑0.1~1.5 mm,長為1 cm,后端管徑為0.6 cm)。必要時可在同一穿刺孔重復取血。此法也適用豚鼠和家兔。
左手持鼠,拇指與食指捏緊頭頸部皮膚,使鼠眼球突出,右手持彎鑷或止血鉗,鉗夾一側(cè)眼球部,將眼球摘出,鼠倒置,頭部向下,此時眼眶很快流血,將血滴入預先加有抗凝劑的玻璃管內(nèi),直至流血停止。此法由于取血過程中動物未死,心臟不斷跳動,一般可取鼠體重4%~5%的血液量,是一種較好的取血方法,但只適用一次性取血。
動物仰臥固定于鼠板上,用剪刀將心前區(qū)毛剪去,用碘酒、酒精消毒此處皮膚,在左側(cè)第3~4肋間用左手食指摸到心搏,右手持連有4~5號針頭的注射器,選擇心搏處穿刺,當針頭正確刺入心臟時,鼠血由于心臟跳動的力量,血自然進入注射器。
實驗者帶上棉手套,用左手抓緊鼠頸部位,右手持剪刀,從鼠頸部剪掉鼠頭迅速將鼠頸端向下,對準備有抗凝劑的試管,收集從頸部流出的血液,小鼠可取血0.8~1.2 ml,大鼠可取血5~10 ml。
麻醉動物背位固定,一側(cè)頸部或腹股溝部去毛,切開皮膚,分離出靜脈或動脈,注射針沿動靜脈走向刺入血管。20 g小鼠可抽血0.6 ml,300 g大鼠可抽血8 ml。也可把頸靜脈或頸動脈用鑷子挑起剪斷,用試管取血或注射器抽血,股靜脈連續(xù)多次取血時,穿刺部位應盡量靠近股靜脈遠心端。